Mukoviszidose — Genmutationstypen und Systemebenen

Aufgabenstellung

Mukoviszidose (Cystische Fibrose, CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung in Mitteleuropa. Die Erkrankung betrifft das CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), das für einen Chloridionenkanal in der Zellmembran codiert. Die mit Abstand häufigste Mutation ist die ΔF508-Mutation, bei der drei aufeinanderfolgende Basenpaare im CFTR-Gen fehlen.

(a) Erklären Sie die drei Genmutationstypen Substitution, Deletion und Insertion anhand jeweils eines kurzen DNA-Beispiels. Zeigen Sie die Auswirkung auf die Aminosäuresequenz. (4 BE)

(b) Bei Mukoviszidose fehlen drei Basenpaare im CFTR-Gen (ΔF508-Mutation). Erläutern Sie, warum diese Deletion keine Leserasterverschiebung verursacht und welche Auswirkung sie auf Proteinebene hat. (4 BE)

(c) Beschreiben Sie die Auswirkungen der ΔF508-Mutation auf drei Systemebenen: molekular, zellulär und organismisch. (6 BE)

(d) In einer Familie ist der Vater heterozygot ($Cc$) und die Mutter ebenfalls heterozygot ($Cc$). Erstellen Sie ein Kreuzungsschema und berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kind erkrankt. (3 BE)

(e) Ein Gentest kann den Trägerstatus bestimmen. Erläutern Sie den Vorteil der Gelelektrophorese zur Unterscheidung von Wildtyp- und Mutations-Allel. (3 BE)

Lösungsweg

Schritt 1: Die drei Genmutationstypen (a)

Substitution — Austausch einer einzelnen Base durch eine andere:

	Codon 1	Codon 2	Codon 3
Original-DNA (Matrizenstrang)	TAC	GGA	AAT
mRNA	AUG	CCU	UUA
Aminosäuren	Met	Pro	Leu
Mutierte DNA	TAC	GAA	AAT
Mutierte mRNA	AUG	CUU	UUA
Mutierte Aminosäuren	Met	Leu	Leu

Eine Substitution betrifft ein einzelnes Basenpaar. Je nach Position kann sie zu einem Aminosäureaustausch führen (Missense-Mutation), ein Stoppcodon erzeugen (Nonsense-Mutation) oder aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes ohne Auswirkung bleiben (stumme Mutation).

Deletion — Verlust einer oder mehrerer Basen:

	Sequenz
Original-mRNA	AUG · CCU · UUA · GCA · …
Aminosäuren	Met – Pro – Leu – Ala – …
Nach Deletion von U (Position 5)	AUG · CCU U → AUG · CCU · AGC · A…
Verschobene Aminosäuren	Met – Pro – Ser – …

Wird eine einzelne Base deletiert, verschiebt sich das gesamte Leseraster ab der Deletionsstelle (Frameshift-Mutation). Alle nachfolgenden Codons werden falsch abgelesen.

Insertion — Einfügen einer oder mehrerer zusätzlicher Basen:

	Sequenz
Original-mRNA	AUG · CCU · UUA · GCA · …
Nach Insertion von G nach Position 4	AUG · CGCU · UUA · GCA · … → AUG · CGC · UUU · AGC · A…
Verschobene Aminosäuren	Met – Arg – Phe – Ser – …

Auch hier kommt es bei Einfügen einer einzelnen Base zur Leserasterverschiebung mit komplett veränderter Aminosäuresequenz.

Schritt 2: ΔF508-Mutation ohne Leserasterverschiebung (b)

Bei der ΔF508-Mutation fehlen exakt drei aufeinanderfolgende Basenpaare (die Basen CTT im codierenden Strang, entsprechend einem Codon). Da das Leseraster auf Tripletts basiert, bleibt es bei einer Deletion von drei Basen (oder einem ganzzahligen Vielfachen von drei) erhalten:

• Drei Basen = ein vollständiges Codon. Dessen Verlust entfernt genau eine Aminosäure, ohne die Ablesung der nachfolgenden Codons zu beeinflussen.
• Im konkreten Fall fehlt die Aminosäure Phenylalanin an Position 508 (daher ΔF508 = Deletion von Phenylalanin 508).

Auswirkung auf Proteinebene: Das CFTR-Protein wird zwar vollständig translatiert (bis auf die fehlende Aminosäure), aber es faltet sich nicht korrekt. Die dreidimensionale Struktur ist gestört, weil Phenylalanin-508 für die korrekte Proteinfaltung essenziell ist. Das fehlgefaltete Protein wird im endoplasmatischen Retikulum (ER) vom Proteinqualitätskontrollsystem erkannt und über den Proteasom-Abbauweg degradiert. Es erreicht daher die Zellmembran nicht.

Schritt 3: Auswirkungen auf drei Systemebenen (c)

Molekulare Ebene:

• Das CFTR-Protein faltet sich durch das Fehlen von Phenylalanin-508 nicht korrekt.
• Das fehlgefaltete Protein wird im ER zurückgehalten und abgebaut (ER-assoziierte Degradation).
• In der Zellmembran fehlt der funktionsfähige CFTR-Chloridionenkanal weitgehend oder vollständig.

Zelluläre Ebene:

• Ohne funktionellen CFTR-Kanal ist der Chloridionentransport aus der Zelle heraus gestört.
• Da der Chloridtransport osmotisch Wasser nachzieht, wird die extrazelluläre Flüssigkeitsschicht auf dem Epithel unzureichend hydratisiert.
• Die von den Epithelzellen produzierte Schleimschicht (Mukus) wird zähflüssig und dickflüssig, weil ihr Wassergehalt zu gering ist.

Organismische Ebene:

• In der Lunge verstopft der zähe Schleim die Bronchien, erschwert die Atmung und begünstigt chronische bakterielle Infektionen (v. a. Pseudomonas aeruginosa).
• Im Pankreas blockiert eingedicktes Sekret die Ausführungsgänge, sodass Verdauungsenzyme nicht in den Dünndarm gelangen → Maldigestion und Untergewicht.
• In den Schweißdrüsen ist die Chlorid-Rückresorption gestört, was zu stark salzhaltigem Schweiß führt (diagnostisch: Schweißtest mit erhöhtem Chloridgehalt > $60\;\text{mmol/l}$).
• Die Lebensqualität und Lebenserwartung der Betroffenen sind erheblich eingeschränkt, auch wenn moderne Therapien die Prognose verbessert haben.

Schritt 4: Kreuzungsschema und Wahrscheinlichkeit (d)

Beide Eltern sind heterozygot: Vater $Cc$, Mutter $Cc$. Dabei steht $C$ für das dominante Wildtyp-Allel und $c$ für das rezessive Mukoviszidose-Allel.

Kreuzungsschema:

	$C$ (Mutter)	$c$ (Mutter)
$C$ (Vater)	$CC$	$Cc$
$c$ (Vater)	$Cc$	$cc$

Genotyp-Verhältnis: $1\;CC : 2\;Cc : 1\;cc$

• $CC$ → gesund, kein Träger (25 %)
• $Cc$ → gesund, Träger (50 %)
• $cc$ → erkrankt (25 %)

$P(\text{Kind erkrankt}) = P(cc) = \frac{1}{4} = 25\,\%$

Schritt 5: Gelelektrophorese zur Unterscheidung der Allele (e)

Bei der Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente nach ihrer Größe aufgetrennt. Da bei der ΔF508-Mutation drei Basenpaare fehlen, ist das Mutations-Allel um genau drei Basenpaare kürzer als das Wildtyp-Allel.

Vorgehensweise und Vorteil:

1. Der relevante Abschnitt des CFTR-Gens wird per PCR amplifiziert (mit Primern, die den Bereich um Position 508 flankieren).
2. Die PCR-Produkte werden auf ein Agarose- oder Polyacrylamidgel aufgetragen und im elektrischen Feld aufgetrennt.
3. Das Wildtyp-Fragment (z. B. 98 bp) wandert langsamer als das Mutations-Fragment (95 bp), da kürzere Fragmente schneller durch die Gelporen wandern.

Ergebnis der Elektrophorese:

• Homozygot gesund ($CC$): eine Bande bei 98 bp.
• Heterozygot ($Cc$): zwei Banden bei 98 bp und 95 bp.
• Homozygot erkrankt ($cc$): eine Bande bei 95 bp.

Der Vorteil gegenüber einer rein klinischen Diagnostik liegt darin, dass heterozygote Träger ($Cc$), die phänotypisch gesund sind, eindeutig identifiziert werden können. Dies ist für die genetische Beratung von großer Bedeutung.

Ergebnis

Frage	Antwort
(a) Mutationstypen	Substitution: Basenaustausch → Aminosäureaustausch möglich; Deletion: Basenverlust → Frameshift; Insertion: Baseneinfügung → Frameshift
(b) ΔF508 ohne Frameshift	Drei Basen = ein Codon; Leseraster bleibt erhalten; Phenylalanin-508 fehlt → Proteinfehlfaltung → Abbau im ER
(c) Drei Systemebenen	Molekular: CFTR fehlt in Membran; Zellulär: gestörter Cl⁻-Transport → zäher Mukus; Organismisch: Lungen-/Pankreasschäden, salziger Schweiß
(d) Kreuzungsschema	$Cc \times Cc$ → $1\;CC : 2\;Cc : 1\;cc$; $P(\text{erkrankt}) = \frac{1}{4} = 25\,\%$
(e) Gelelektrophorese	PCR-Amplifikation + Gelauftrennung: Wildtyp 98 bp, Mutation 95 bp; heterozygote Träger zeigen zwei Banden