PCR und Gelelektrophorese — Molekulargenetische Methoden

Aufgabenstellung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Gelelektrophorese zählen zu den wichtigsten Methoden der Molekulargenetik. Sie werden in der medizinischen Diagnostik, der Forensik und der Grundlagenforschung eingesetzt.

(a) Beschreiben Sie die drei Schritte eines PCR-Zyklus (Denaturierung, Annealing, Elongation) mit Angabe der jeweiligen Temperaturen und Funktionen. (4 BE)

(b) Berechnen Sie, wie viele DNA-Kopien nach 20 PCR-Zyklen aus einem einzelnen Ausgangsmolekül theoretisch entstehen. (3 BE)

(c) Bei der Gelelektrophorese wandern DNA-Fragmente im elektrischen Feld. Erklären Sie, warum kürzere Fragmente weiter wandern als längere, und wie man daraus auf die Fragmentgrößen schließen kann. (4 BE)

(d) Ein Patient wird auf eine Genmutation getestet. Die Gelelektrophorese zeigt bei ihm zwei Banden (500 bp und 300 bp), beim Wildtyp nur eine Bande (500 bp). Interpretieren Sie das Ergebnis. (4 BE)

Lösungsweg

Schritt 1: Die drei Schritte eines PCR-Zyklus (a)

Die PCR vervielfältigt einen spezifischen DNA-Abschnitt in drei zyklisch wiederholten Schritten:

1. Denaturierung — Temperatur: $95\;°\text{C}$

Die doppelsträngige DNA wird auf $95\;°\text{C}$ erhitzt.
Durch die hohe Temperatur brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren auf.
Die DNA-Doppelhelix trennt sich in zwei Einzelstränge (Template-Stränge).
Dieser Schritt dauert typischerweise 30 Sekunden bis 1 Minute.

2. Annealing (Primerhybridisierung) — Temperatur: $55\text{–}65\;°\text{C}$

Die Temperatur wird auf $55\text{–}65\;°\text{C}$ gesenkt.
Zwei kurze, synthetische Oligonukleotid-Primer (je ca. 18–25 Nukleotide lang) lagern sich nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung an die Einzelstränge an.
Ein Primer bindet am 3’-Ende des einen Strangs, der andere am 3’-Ende des Gegenstrangs. Gemeinsam flankieren sie den zu amplifizierenden Zielabschnitt.
Die genaue Annealing-Temperatur hängt von der Länge und dem GC-Gehalt der Primer ab.

3. Elongation (Verlängerung) — Temperatur: $72\;°\text{C}$

Die Temperatur wird auf $72\;°\text{C}$ erhöht — das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase (hitzestabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus).
Die Taq-Polymerase verlängert die Primer in 5’→3’-Richtung, indem sie freie Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) komplementär zum Template-Strang einbaut.
Am Ende der Elongation liegt jeder Einzelstrang wieder als Doppelstrang vor.
Ein Elongationsschritt dauert ca. 1 Minute pro 1000 bp Zielfragment.

Schritt 2: Berechnung der DNA-Kopien nach 20 Zyklen (b)

In jedem PCR-Zyklus wird die vorhandene DNA-Menge verdoppelt (idealisiert). Ausgehend von einem einzelnen Ausgangsmolekül gilt:

$N = 2^n$

wobei $N$ die Anzahl der DNA-Kopien und $n$ die Anzahl der Zyklen ist.

Nach $n = 20$ Zyklen:

$N = 2^{20} = 1\,048\,576$

Aus einem einzigen DNA-Ausgangsmolekül entstehen theoretisch über eine Million Kopien ( $\approx 1{,}05 \cdot 10^6$ ).

Anmerkung: In der Praxis liegt die Effizienz unter 100 %, da Primer, dNTPs und Polymerase-Aktivität limitierend wirken. Die tatsächliche Kopienzahl ist daher etwas geringer, liegt aber dennoch in der Größenordnung von $10^5$ bis $10^6$ .

Schritt 3: Wanderungsverhalten bei der Gelelektrophorese (c)

Prinzip der Auftrennung:

DNA-Moleküle tragen aufgrund ihrer Phosphatgruppen im Rückgrat eine negative Ladung. Im elektrischen Feld wandern sie daher vom Minuspol (Kathode) zum Pluspol (Anode).

Das Agarose- oder Polyacrylamidgel bildet ein Netzwerk aus Poren, durch das die DNA-Fragmente hindurchwandern müssen. Dabei gilt:

Kürzere Fragmente (geringere Molekülmasse) können die Poren des Gels leichter passieren und wandern daher schneller und weiter in Richtung Anode.
Längere Fragmente (größere Molekülmasse) werden stärker durch das Porennetzwerk zurückgehalten und wandern langsamer — sie bleiben näher an der Auftragsstelle.

Die Wanderungsstrecke ist dabei annähernd proportional zum Logarithmus der Fragmentlänge: Trägt man $\log(\text{Fragmentgröße in bp})$ gegen die Wanderungsstrecke auf, ergibt sich eine annähernd lineare Beziehung.

Größenbestimmung mittels Marker:

Zur Bestimmung unbekannter Fragmentgrößen wird parallel ein DNA-Längenstandard (Größenmarker, „DNA-Ladder”) auf das Gel aufgetragen. Dieser enthält DNA-Fragmente bekannter Größe (z. B. 100 bp, 200 bp, 500 bp, 1000 bp). Durch Vergleich der Laufstrecke der unbekannten Fragmente mit der Position der Marker-Banden kann die Fragmentgröße abgelesen werden.

Schritt 4: Interpretation des Bandenmusters (d)

Befund:

Wildtyp (gesunde Kontrollperson): eine einzige Bande bei 500 bp.
Patient: zwei Banden bei 500 bp und 300 bp.

Interpretation:

Der zu untersuchende DNA-Abschnitt wurde per PCR amplifiziert und anschließend mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das eine spezifische Erkennungssequenz besitzt.

Beim Wildtyp enthält das PCR-Produkt keine Schnittstelle für das verwendete Restriktionsenzym. Das Fragment bleibt daher intakt und zeigt eine einzige Bande bei 500 bp.
Beim Patienten hat die Genmutation eine neue Restriktionsschnittstelle erzeugt (oder: die Mutation hat eine bestehende Schnittstelle verändert, sodass das Enzym nun schneiden kann). Das 500-bp-Fragment wird an der Schnittstelle in zwei Fragmente von ca. 300 bp und 200 bp geteilt.
Das gleichzeitige Vorhandensein der ungeschnittenen Bande (500 bp) und der geschnittenen Bande (300 bp) zeigt, dass der Patient heterozygot ist: Er besitzt ein Wildtyp-Allel (500 bp, keine Schnittstelle) und ein mutiertes Allel (wird geschnitten → 300 bp + 200 bp).
Die dritte Bande bei ca. 200 bp ist möglicherweise aufgrund der geringen Größe weniger gut sichtbar oder wurde in der Aufgabenstellung vereinfacht nicht genannt.

Diagnose: Der Patient ist heterozygoter Träger der Mutation. Er besitzt ein normales und ein mutiertes Allel. Falls die Erkrankung autosomal-rezessiv vererbt wird, ist der Patient phänotypisch gesund, aber Überträger.

Ergebnis

Frage	Antwort
(a) PCR-Schritte	1. Denaturierung ( $95\;°\text{C}$ ): DNA-Trennung in Einzelstränge; 2. Annealing ( $55\text{–}65\;°\text{C}$ ): Primer-Hybridisierung; 3. Elongation ( $72\;°\text{C}$ ): Taq-Polymerase synthetisiert Komplementärstrang
(b) Kopienanzahl	$2^{20} = 1\,048\,576$ Kopien aus einem Ausgangsmolekül
(c) Wanderung im Gel	Kürzere Fragmente passieren Gelporen leichter → wandern weiter; Größenbestimmung durch Vergleich mit DNA-Längenstandard
(d) Bandenmuster Patient	Zwei Banden (500 bp + 300 bp) → heterozygoter Träger; Wildtyp-Allel ungeschnitten (500 bp), Mutations-Allel durch Restriktionsenzym geschnitten (300 bp + 200 bp)